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学术研究设计

综合学术研究技能：实验方案设计、文献检索、研究规划

适用场景: 实验方案设计, 研究规划, 文献综述

难度: advanced

触发提示: "帮我设计实验方案"

别名: 实验方案, 研究设计, experiment design, 研究方案

When to Use

适用于: 实验方案设计, 研究规划, 文献综述

执行模板 — CNS 级研究方案生成

当用户请求生成研究方案时，必须按以下 10 段模板输出。禁止省略任何一个段落。

## 研究方案: {species} {tissue} {direction}

### 1. 核心假说 (Core Hypothesis)
- **生物学问题**: 用 1-2 句话描述要回答的生物学问题
- **已发表工作缺口 (Gap)**: 对比 [KB] 中的文献，说明现有知识缺少什么
- **零假说 (H₀)**: 无效应/无差异的陈述
- **备择假说 (H₁)**: 本研究要验证的主张
- **预测链**: 如果 H₁ 成立 → 预期观察 A → 预期观察 B → 预期观察 C
  - 预测 A: {用数据X的方法Y检验}
  - 预测 B: ...
  - 预测 C: ...

### 2. 创新性声明 (Novelty Statement)
- **本研究 vs 已发表工作**: 与 [KB: 论文名] 相比，本研究的独特之处在于:
  - (1) 新数据/新物种/新组织
  - (2) 新方法/新组合
  - (3) 新假说/新角度
- **潜在领域贡献**: 如果假说成立，将改变 __ 的认知

### 3. 文献依据 (Literature Foundation)
| 文献(作者+年份,PMID/DOI) | 关键方法 | 与本方案关系 | 来源 |
|--------------------------|----------|-------------|------|
| ... | Seurat v4.0.2, SCTransform | 方法参考+可复现性 | [KB] |
| ... | ... | ... | [PMID:xxx] |

### 4. 分析方法与论证 (Methods & Rationale)
每个方法必须回答: **为什么选这个方法？它验证假说的哪一部分？**
1. **数据预处理**: [KB] Seurat v4.0.2 → SCTransform
   - 理由: SCTransform 优于 LogNormalize 因为 [具体理由，如 UMI count 异方差性]
   - 验证: 预测 A (细胞类型鉴定)
2. **批次校正**: [KB] Harmony v1.0
   - 理由: 优于 Seurat CCA 因为 [datasets 大小不均/跨物种]
   - 验证: 预测 A (确保 cell type 而非 batch 驱动聚类)
3. ...
每个方法的理由必须有实质性内容，不能只说"常用"/"标准"

### 5. 统计方案 (Statistical Plan)

> **针对多因素干预研究**（如衰老×疾病×运动），统计设计须特别注意：
> - **交互效应检验**：DESeq2/limma 公式 `~ group + time + group:time`，检验 FDR < 0.05 的交互 DEGs
> - **两轮策略**：第一轮做组内配对对比（pre vs post），第二轮比较效应量的组间差异（meta-analytic thinking）
> - **小型样本**（每组 n≤3）：降维为"一阶效应对比 + 效应量比较"而非 full factorial；使用 MCMC 建模
> - **协变量控制**：将额外临床指标（BMI, HbA1c, VO2max）纳入线性模型

- **统计功效**: 基于预期效应量 ___ (Cohen's d/log2FC)，显著性 α=0.05，需≥___ 样本
- **多重检验校正**: BH (FDR < 0.05) 或 Bonferroni (当检验数<10时)
- **效应量度量**: log2FC ≥ 0.5（scRNA-seq）/ ≥ 1.0（bulk RNA-seq）, Cohen's d ≥ 0.8
- **阴性对照**: (如: shuffled labels, permuted genotypes, shuffled cell type labels)
- **阳性对照**: (如: 已知衰老标记基因 SenMayo/CellAge, 已知运动应答基因 PPARGC1A/ESRRG)
- **批次效应评估**: kBET, LISI score

### 6. Figure 策略 (Figure Strategy)

> **多因素干预研究特别指导**：参考 `references/multi-factor-study-design.md` 的 Phase 1-4 框架
> - Phase 1 → Figure 1（基线图谱）
> - Phase 2 → Figure 2（干预效果）
> - Phase 3 → Figure 3（机制深挖）
> - Phase 4 → Figure 4+（整合与模型）
> - 每个 Phase 的 Figure 结构见参考文件中的具体模板

**每张Figure对应假说的一个预测，必须写明预期结果:**
- **Figure 1**: [验证预测A] {标题}
  - 内容: UMAP/标记基因表达
  - 预期结果: 明确cluster分离，已知marker在对应cluster高表达
  - 如预期不符合: [备选] 调整分辨率，手动注释
- **Figure 2**: [验证预测B] {标题}
  - 内容: 差异表达 + 通路富集
  - 预期结果: DEGs富集于衰老通路，SenMayo基因集上调
  - 如预期不符合: [备选] GSEA替代ORA，降低FDR阈值
- **Figure 3**: [验证预测C] {标题}
  - 内容: ...
参见 `references/cns-figure-trinity.md` 获取详细模板和真实案例。

## ⚠️ 知识库引用规则
- **正交验证**: (如 IF 染色验证蛋白水平、RNA-FISH 验证空间定位、qPCR 验证关键基因)
- **公共数据验证**: (如 Tabula Muris Senis, GTEx, Human Cell Atlas)
- **阳性对照基因集**: SenMayo / CellAge / GO:0007568 (aging)
- **如果全部预测被证伪**: 报告 negative result，讨论原因（统计功效不足？假说错误？）

### 8. 备选方案与风险 (Contingency Plan)
| 风险 | 可能性 (高/中/低) | 缓解策略 |
|------|-------------------|----------|
| 细胞数/基因数不足 (QC过滤过严) | 中 | 降低 MT%阈值，用 EmptyDrops 替代 |
| 批次效应无法消除 | 低 | 切换 Seurat CCA+RPCA，分析每个 batch 单独验证 |
| 假说被完全证伪 | 低 | 转向 explorative analysis，报告 negative result |
| [KB] 方法不适合本研究 | 中 | 回退到 [PMID:xxx] 中的备选方法 |

### 9. 可复现性声明 (Reproducibility)
- **代码**: GitHub/Figshare (提交时附URL)
- **数据**: GEO accession / EGA / dbGaP (如有)
- **环境**: Docker/Singularity 容器 + conda env yaml → 提供 container URL
- **随机种子**: set.seed(42) / random_state=42

### 10. 可执行待办
调用 memomics_pipeline(action='todos', selected_modules=[...])

### 11. 交付格式
用户要求"生成完整方案"时，必须以 **可编辑文档（DOCX优先）** 交付，同时生成 PDF。
- 使用 python-docx 生成 Word 文档，路径: `results/research_proposal/{species}_{tissue}_{direction}_CNS方案_v{version}.docx`
- 使用 reportlab 生成 PDF 附件
- 脚本保留在 `results/research_proposal/generate_proposal.py`，可复现修改

## ⚠️ 用户偏好嵌入（2026-07-13 会话）

当用户（尤其是骨骼肌衰老方向）要求CNS级方案时，已纠正过的问题：
| 用户投诉 | 根因 | 必须做到 |
|---------|------|---------|
| "太泛了，深度不够" | 只有方法列表，无论文级phased结构 | Phase 1-5分层 + Figure三一结构 |
| "不分阶段" | 一次性讲所有内容 | 每Phase只答一个生物学问题 |
| "看看人家文章怎么探究的" | 缺论文技术对照表 | 必须有：参考论文 vs 本研究 Figure/方法对应表 |
| "太泛"（再次） | 预测无具体数值 | 必须写"Type II从49%→29%"这类精确数值+文献依据 |
| 无可执行性 | 只讲"做什么"不讲"顺序" | Phase级待办清单 + skill绑定 |